Ensinnäkin sekä EcoR1 että Xba1 jättävät 5'-ulokkeet pilkkoessaan DNA:ta (kuten myös Nde1). Molemmissa tapauksissa 3'-pää on upotettu, minkä vuoksi polyermaasilla voidaan lisätä pohjaa. Toiseksi kaikki polymeraasit voivat lisätä emäksiä vain 3'-päähän, joten Klenow lisää 4 emästä molempien kohtien taantuneen 3'-päähän tuottaakseen tylpät päät.
Jättävätkö restriktioentsyymit 5-fosfaattia?
Restriktioentsyymeillä digestoidut vektorit ja insertit sisältävät tarvittavat terminaaliset modifikaatiot (5'-fosfaatti ja 3'-hydroksyyli), kun taas polymeraasiketjureaktion (PCR) tuottamat fragmentit eivät välttämättä.
Voidaanko tylpät päät sitoa?
Tylppään pään ligaation
Tylppään pään ligaatio ei sisällä ulkonevien päiden emäspariutumista, joten mikä tahansa tylppä pää voidaan liittää toiseen tylppään päähän. Tylppät päät voivat muodostua restriktioentsyymeillä, kuten Smal ja EcoRV.
Tuottaako Taq-polymeraasi tylsät päät?
Kyllä… Taq Polymerase lisää A-ylityskohtia, jos pidät viimeisen pidennysvaiheen 72 dC:ssa PCR:ssä. Käytetään enimmäkseen TA-kloonaukseen.
Miksi käyttää Klenowin fragmenttia DNA-sekvensoinnissa?
Klenowin fragmentti on erittäin hyödyllinen tutkimukseen perustuvissa tehtävissä, kuten: Kaksijuosteisen DNA:n synteesi yksijuosteisista templaateista . DNA-fragmenttien vetäytyneiden 3'-päiden täyttö, jotta 5'-ylitys on tylppä . Digeting pois ulkonevat 3' ulkonemat.
