Kun solut näyttävät irronneen, lisää 2 tilavuutta esilämmitettyä täydellistä kasvualustaa trypsiinin inaktivoimiseksi. Levitä väliaine varovasti pipeteillä solukerroksen pinnalle useita kertoja varmistaaksesi, että >95 % soluista saadaan t alteen.
Kuinka lopetan trypsiinitoiminnan?
Trypsiinin pilkkominen voidaan pysäyttää jäädyttämällä tai alentamalla reaktion pH alle pH 4:n lisäämällä muurahais-, etikka- tai trifluorietikkahappoa (trypsiini aktivoituu uudelleen, kun pH nostetaan yli pH 4). Digestoidut näytteet voidaan säilyttää -20°C:ssa.
Mikä neutraloi trypsiinin?
Puskuri kalsium- ja magnesiumioneja sisältävä hidastaa myös trypsiinin toimintaa. FBS on kuitenkin tehokkaampi tapa estää trypsiiniaktiivisuutta.
Inaktivoiko seerumi trypsiiniä?
Seerumi inaktivoi munuaisten entsymaattisesta pilkkomisesta jäljelle jääneen trypsiinin ja solujen myöhemmin syntetisoimat proteolyyttiset entsyymit. Juuri trypsinoidut solut voitiin kasvattaa yksikerroksiksi ilman seerumia edellyttäen, että ne pestään toistuvasti trypsiinijäämien poistamiseksi.
Kuinka paljon materiaalia tarvitaan trypsiinin poistamiseen käytöstä?
Niin kauan kuin käytät vähintään 1:1 suhteessa 5-10 % seerumia sisältävää väliainetta trypsiinin kanssa, eston pitäisi olla enemmän kuin riittävä ja sen jälkeen sentrifugoitu ja väliaineen vaihto tuoreeseen väliaineeseen.
